文献解读：OCUS应用于小鼠肝脏脂滴代谢的调控机制研究
非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病和心血管疾病的发展密切相关，并且是许多晚期肝病的主要因素。NAFLD的全球发病率超过25%，且正在迅速增加，已成为危害人类健康的重大代谢性疾病。非酒精性脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis，NASH）是NAFLD的晚期阶段，在NAFLD中的发病率约为25-30%。针对NAFLD / NASH，目前尚无既定疗法或FDA批准的药物，其发病机理和潜在机制也大多未知。因此，探究并确定一种新的药理方法用于NAFLD / NASH的有效临床治疗是至关重要的。
2022年11月，深圳大学苏文研究员、华东师范大学张晓燕教授与大连医科大学管又飞教授团队，在Nature Communications上发表题为“Phosphorylation of 17β-hydroxysteroid dehydrogenase 13 at serine 33 attenuates nonalcoholic fatty liver disease in mice”的文章，揭示了17β-HSD13的蛋白磷酸化对肝细胞脂滴代谢的重要调控机制，并提出了一种新的靶向治疗NAFLD方案。已有研究证明新型肝脂滴蛋白17β-HSD13（属于17β类固醇脱氢酶），特异性表达于肝脏脂滴表面，其过表达可显著促进脂肪肝的发生和发展，提示17β-HSD13可能在脂肪肝的干预治疗中具有重要价值，但其确切功能及相关调控机制仍不清楚。本文研究中该联合团队发现，在肝细胞内17β-HSD13和肝脏重要水解酶——脂肪甘油三酯脂肪酶（Adipose triglyceride lipase，ATGL）及其辅因子CGI-58（Comparative gene identification 58）三者间存在动态的结合，PKA信号通路的激活可以使17β-HSD13的丝氨酸33位磷酸化，从而增加CGI-58对ATGL的激活，进而促进脂滴中甘油三酯的水解和线粒体的β-氧化，从而改善肝细胞内甘油三酯的积累。
为了研究17β-HSD13丝氨酸33位磷酸化与NAFLD的功能相关性，研究人员使用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建了33位丙氨酸替代的丝氨酸表达失活型(S33A)小鼠模型Hsd17B1333A/A，并与野生型（Wild type，WT）对照组小鼠Hsd17b13+/+共同饲养5个月，Hsd17B1333A/A小鼠出现显著的脂肪肝表型，经H&E和油红O染色切片扫描（由芬兰Grundium的Ocus便携式数字病理切片显微成像系统进行扫描），结果显示Hsd17B1333A/A小鼠的肝部中央静脉区域大量蓄积更大尺寸的肝细胞脂滴，同时IHC结果也显示F4/80+和CD68+细胞浸润（如图1红框）。结合其他相关实验，证明17β-HSD13的丝氨酸33位磷酸化障碍促进了正常饮食小鼠的肝脏脂质积累和炎症发生。
图1 丝氨酸表达失活型小鼠肝细胞脂滴染色结果
之后，为确定脂滴水解功能障碍是否会促进NASH的发生和发展，研究人员用高脂肪饮食（High-fat diet，HFD）喂养Hsd17b13+/+和Hsd17B1333A/A小鼠3个月。经组织学检查、油红O和Masson染色分析，Hsd17B1333A/A小鼠比Hsd17b13+/+小鼠表现出更严重的肝脏脂质积累、肝细胞气球化和细胞外基质沉积症状，IHC扫描结果显示，与WT小鼠相比，Hsd17B1333A/A小鼠的肝脏炎症和纤维化进程显著加快（如图2）。利用腺病毒载体AAV在小鼠肝内诱导表达进行协同验证，得到类似结果（如图3）。相关实验证明了Ser33残基是17β-HSD13重要的磷酸化位点，并可能参与到ATGL依赖型脂肪水解的调控中，Ser33残基的靶向突变促进了NASH的发展。
图2 HFD喂养小鼠肝组织染色结果
图3 腺病毒AAV在小鼠肝内诱导表达后的肝组织染色结果
在获得17β-HSD13丝氨酸33位磷酸化调控NALFD的相关结论后，研究人员通过计算机辅助药物设计技术，从FDA批准的小分子药物库中筛选出干预NAFLD的潜在药物—原用于治疗哮喘的瑞普特罗。继而单独对实验组小鼠进行瑞普特罗给药，油红O、H&E和Masson染色相关研究结果显示，相比对照组HF-Ctrl，实验组小鼠HF-R的肝脏脂滴大小和数量均显著减少（如图4）。同时结合蛋白和酯类的表达分析，瑞普特罗可以通过激活PKA信号通路增加17β-HSD13丝氨酸33位的磷酸化，并抑制NALFD的发生和发展，进一步提示靶向17β-HSD13丝氨酸33位磷酸化可能是干预NAFLD的潜在药物靶点。
图4 瑞普特罗给药后肝组织染色结果
综上所述，此项研究证实了17β-HSD13是PKA新的磷酸化底物，阐明了17β-HSD13丝氨酸33位磷酸化在调控肝脏脂滴代谢中的重要作用，揭示了PKA / 17β-HSD13 / ATGL信号轴在干预脂肪肝发生和发展中的作用机制，为靶向17β-HSD13治疗NAFLD及相关代谢疾病提供了重要的理论基础。
文章中小鼠病理组织经H&E染色、油红O染色、IHC免疫组化及Masson染色后，均使用芬兰Grundium公司生产的OCUS便携式数字病理切片显微成像系统进行扫描。
芬兰Grundium公司自主研发和生产了全球领先的便携式数字病理扫描显微成像系统--Ocus。设备具有双层可移动载物台，根据自动圈选的区域，结合专利的软件算法采取螺旋路径等非直线扫描模式，快速完成扫描。Ocus每个视野独立自动对焦，可有效避免切片厚薄不均导致的图像问题，且采集的图片自动无缝拼接生成超高清图片，不遗漏任何有价值的信息。Ocus的访问和操作均采用浏览器模式，通过有线、无线或Ocus自带热点的链接，无需安装额外的软件或app，通过手机、Pad或电脑即可实现仪器的访问和操控。同时机器整合了现代的通讯技术，支持多人实时共享高清图片和远程操控仪器，让远程会诊、学术交流和教育更加便利。
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https://doi.org/10.1038/s41467-022-34299-1
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