Pippin系列全自动DNA片段回收仪在RAD-seq和MeD-seq文库制备中的应用
前两期我们介绍了Sage系列产品在Small RNA、ChiP-seq、cffDNA和ctDNA测序中的应用，本期我们将介绍Sage系列产品在RAD seq和甲基化测序中的应用。
RAD-seq 相关应用
RAD-seq技术，是广泛用于遗传多样性测序技术的一种。利用限制性内切酶消化以降低基因组的复杂度，对特定酶切片段进行NGS高通量测序，实现基因分型的技术。
RAD-seq不仅实验操作简单，性价比高，更为重要的是他并不依赖参考基因组的信息，一次测序即可获得数以万计的多态性遗传标记，已广泛应用于生态学、遗传学、基因组学等研究领域。
在ddRAD-seq实验流程中，Pippin 系列全自动DNA片段回收仪，可以降低片段选择过程对相同位点在文库间代表性的影响，另外通过实验初期的监测，可以评估样品的酶切片段均匀度，排除转座子等高频出现的片段。
图1 某研究中研究人员开发的两次回收构建RAD seq文库的方法
相关文献：
| 1 | Jiang, Ning, et al. "A highly robust and optimized sequence-based approach for genetic polymorphism discovery and genotyping in large plant populations." Theoretical and Applied Genetics 129.9 (2016): 1739-1757. |
| 2 | Auteri, Giorgia G., and L. Lacey Knowles. "Decimated little brown bats show potential for adaptive change." Scientific Reports 10.1 (2020): 3023. |
| 3 | Rubi, Tricia L., L. Lacey Knowles, and Ben Dantzer. "Museum epigenomics: Characterizing cytosine methylation in historic museum specimens." Molecular ecology resources 20.5 (2020): 1161-1170. |
| 4 | Kim, Han-Na, et al. "The Origin and Invasion Pathway of Brown Rats Rattus norvegicus on Dok-Do Island Revealed by Genome-Wide Markers from 3-RADseq Approach." Animals 13.7 (2023): 1243. |
| 5 | Gargiulo, Roberta, Tiiu Kull, and Michael F. Fay. "Effective double‐digest RAD sequencing and genotyping despite large genome size." Molecular Ecology Resources 21.4 (2021): 1037-1055. |
| 6 | Goodall, Jake, et al. "RAD sequencing of common whelk, Buccinum undatum, reveals fine‐scale population structuring in Europe and cryptic speciation within the North Atlantic." Ecology and Evolution 11.6 (2021): 2616-2629. |
甲基化测序（MeD-seq）应用
甲基化测序是一类专门分析DNA分子中胞嘧啶（C）甲基化水平的测序分析技术。其主要原理是通过将DNA中非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶（U），继而进行测序的技术手段。由于正常情况下胞嘧啶的配对碱基是鸟嘌呤（G），而尿嘧啶的配对碱基是腺嘌呤（A）。这样就可以在生成配对序列时产生不同的序列，进一步通过测序分析和参考链比较，以了解哪些部位发生了甲基化。
目前，减少代表性亚硫酸氢盐测序（Reduced Representation Bisulfite Sequencing ，RRBS）覆盖了大部分的基因启动子和CpG岛，但是对CpG周围和其他有生物学意义的基因间区域的覆盖却不足。因此有越来越多的研究人员开发了增强减少代表性亚硫酸氢盐测序技术（Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing ，ERRBS）。ERRBS技术可以在在产生的数据中有覆盖更多的CpG，并增加了所有待测基因组区域的覆盖率，因此改善了RRBS在甲基化测序中的缺陷。其中在Garrett-Bakelman等人设计的ERRBS方法，通过利用Pippin Prep回收135-410bp的DNA片段，可以高效回收25ng以上的DNA并用于构建DNA文库，经过验证是一种可行的甲基化测序技术。
图2 Garrett-Bakelman的方法文献中针对甲基化的文库构建参数
相关文献：
| 1 | Garrett-Bakelman, Francine E., et al. "Enhanced reduced representation bisulfite sequencing for assessment of DNA methylation at base pair resolution." JoVE (Journal of Visualized Experiments) 96 (2015): e52246. |
| 2 | Smit, Kyra N., et al. "Genome-wide aberrant methylation in primary metastatic UM and their matched metastases." Scientific Reports 12.1 (2022): 42. |
| 3 | Shankar, Anusha S., et al. "Kidney organoids are capable of forming tumors, but not teratomas." Stem Cells 40.6 (2022): 577-591. |
| 4 | Siamoglou, Stavroula, et al. "Genome-wide analysis toward the epigenetic aetiology of myelodysplastic syndrome disease progression and pharmacoepigenomic basis of hypomethylating agents drug treatment response." Human Genomics 17.1 (2023): 1-12. |
| 5 | Siamoglou, Stavroula, et al. "Genome-wide analysis toward the epigenetic aetiology of myelodysplastic syndrome disease progression and pharmacoepigenomic basis of hypomethylating agents drug treatment response." Human Genomics 17.1 (2023): 1-12. |
| 6 | Wang, Maojun, et al. "Multi-omics maps of cotton fibre reveal epigenetic basis for staged single-cell differentiation." Nucleic Acids Research 44.9 (2016): 4067-4079. |
| 7 | Wilbanks, Elizabeth G., et al. "Metagenomic methylation patterns resolve complex microbial genomes." bioRxiv (2021): 2021-01. |
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